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    • 专利摘要:
    Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnologischen Herstellung von funktionalisierten Di- und Tricarbonsäuren, vorzugsweise zur Herstellung der im Tricarbonsäurecyclus vorkommenden Citronensäure, Isocitronensäure, 2-Oxoglutarsäure, Aconitsäure und/oder Itaconsäure unter Verwendung von Alkylestern gesättigter und/oder ungesättigter Monocarbonsäuren (Fettsäuren) mit einer Kettenlänge von 8 bis 22 C-Atomen als Hauptkohlenstoffquelle bei der Kultivierung von Mikroorganismen unter aeroben, submersen Bedingungen. Bevorzugte Mikroorganismen sind säureakkumulierende Hefen, wie z. B. die säurebildenden Hefenstämme der Gattungen Candida, Pichia und Yarrowia. Besonders bevorzugt werden zur Kultivierung der Mikroorganismen die Alkylester in Form preiswerter handelüblicher Biodiesel-Kraftstoffgemische dem Kultivierungsmedium zugesetzt.
    公开号:DE102004028179A1
    申请号:DE200410028179
    申请日:2004-06-04
    公开日:2006-01-19
    发明作者:Andreas Dr.-Ing. Aurich；Gerold Prof. Dr. Barth；Andre Förster；Stefan Dr. Mauersberger；Ulrich Prof. Dr. Stottmeister
    申请人:TECH UNI DRESDEN I fur MIKROB；Technische Universitat Dresden Institut fur Mikrobiologie；Helmholtz Zentrum fuer Umweltforschung UFZ GmbH；
    IPC主号:C12P7-44
    专利说明:
    [0001] DieErfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnologischen Herstellungvon funktionalisierten Di- und Tricarbonsäuren, vorzugsweise zur Herstellungder im Tricarbonsäurecyclusvorkommenden Citronensäure, Isocitronensäure, 2-Oxoglutarsäure, Aconitsäure und/oderItaconsäureunter Verwendung von Alkylestern gesättigter und/oder ungesättigterMonocarbonsäuren(Fettsäuren)mit einer Kettenlängevon 8 bis 22 C-Atomen als Hauptkohlenstoffquelle bei der Kultivierungvon Mikroorganismen unter aeroben, submersen Bedingungen. BevorzugteMikroorganismen sind säureakkumulierendeHefen, wie z.B. die säurebildendenHefenstämmeder Gattungen Candida, Pichia und Yarrowia. Besonders bevorzugtwerden zur Kultivierung der Mikroorganismen die Alkylester in Formpreiswerter handelsüblicherBiodiesel-Kraftstoffgemischedem Kultivierungsmedium zugesetzt.
    [0002] Anfunktionalisierten Di- und Tricarbonsäuren, insbesondere an Citronensäure (2-Hydroxypropan-1,2,3-tricarbonsäure) bestehtaufgrund ihrer komplexbildenden, geschmacklichen, antioxidativenund farbstabilisierenden Eigenschaften ein hoher Bedarf. Sie werdenseit Jahrzehnten biotechnologisch im großtechnischen Maßstab gewonnen.Als Produktionsverfahren fürCitronensäuresind Submersverfahren mit Hochleistungsstämmen des Pilzes Aspergillusniger etabliert, wobei Zuckermelassen und andere kohlenhydrathaltigeAbprodukte aber auch Saccharose, Glucose und Stärkehydrolysate als Substratedienen. Im diskontinuierlichen Aspergillus-Prozess werden Citronensäurekonzentrationenvon 100–130g/l bei Ausbeuten von 0,8–0,9g/g Kohlenhydrat bei einer Kultivierungszeit von 5 bis 6 Tagen erzielt.Trotz jahrzehntelanger Verwendung dieser Kohlenstoffquellen sindeine Reihe von Nachteilen bekannt, die ihre Verwendung einschränken oderteilweise verbieten: z.B. schlechte Substratbevorratung bei batch-Verfahrendurch physiologische Rückkopplungenbei hohen Zuckerkonzentrationen (z.B. Crabtree-Effekt), herabgesetzteSauerstofflöslichkeit, Schaumbildungbei Belüftung,hohe Infektionsanfälligkeitund Substrathemmungen durch Schwermetallgehalt bei Melassen.
    [0003] Seitden 60er Jahren des vorigen Jahrhunderts wurden alternativ zahlreicheVerfahren zur Citronensäuregewinnungmit Hefestämmenentwickelt, insbesondere Verfahren mit Hefen der Gattungen Candidaund Yarrowia unter Verwendung von Paraffinen (Alkanen), insbesondereder C9-C23-Fraktion,bzw. Verfahren mit Nichtkohlehydratsubstraten (Reviews: Röhr, M. (1998),A century of citric acid fermentation and research. Food Technol.Biotechnol. 36, 163–171;Stottmeister, U., Behrens, U., Weissbrodt, E., Barth, G., Franke-Rinker,D. und Schulze, E. (1982) Nutzung von Paraffinen und anderen Nicht-Kohlenstoffquellenzur mikrobiellen Citronensäuresynthese.Z. Allg Mikrobiol 22: 399–424).Im Vergleich mit A. niger konnten mit den Hefen auf Paraffinen nach5–7 TagenKultivierungsdauer höhereProduktkonzentrationen an Citronensäure (170–180 g/l) und Ausbeuten von1,6–1,8g/g erzielt werden. Extrem steigende Erdölpreise in den 70er Jahrenund Vorbehalte wegen etwaiger carcinogener Rückstände im Endprodukt standen einerEtablierung von verfahren zur Citronensäurebildung aus Paraffinen jedochim Wege.
    [0004] Deshalbwurden auch Fermentationsverfahren zur Citronensäuregewinnung mittels Hefen,insbesondere mit Candida lipolytica, unter Nutzung von physiologischunbedenklichen lipophilen Substraten aus erneuerbaren biogenen Ressourcenentwickelt. So sind z.B. Verfahren unter Verwendung von unbehandeltentierischen Fetten oder in Form von Talg als Substrate beschrieben( GB 1403336 A ).Andere Verfahren beschreiben die Verwendung von Pflanzenölen alsKohlenstoffquelle, wie z.B. Palmöl( GB 2143527 A )oder die Verwendung von Planzenölenmit niedriger Jodzahl ( GB1456784 A ). Aus verschiedenen Pflanzenölen mit geringer Jodzahl (z.B.Palmöl)konnten bei massespezifischen Kohlenstoffgehalten, welche im Bereichvon Paraffinen liegen, bis zu 150 g/l Citronensäure und Ausbeuten bis zu 1,5g/g erzielt werden. Tierische Fette bestehen i.d.R. aus einem Gemischvon Glycerinestern von Fettsäuren,auch Pflanzenölebeinhalten zu 95 bis 98% ein Gemisch aus unterschiedlichen Glyceriden,Begleitstoffe sind freie Fettsäuren,Phospholipide, Farbstoffe, Sterine und Ether. Nachteilig bei derVerwendung dieser Art von Rohstoffen ist, dass diese Substrate beiden erforderlichen Kultivierungstemperaturen von 26–33°C entwedergenerell in fester Form vorliegen (Fette, Palmöl) oder in flüssiger Formeine im Vergleich mit Paraffinen wesentlich höhere Viskosität und Oberflächenspannungaufweisen. Es ist daher bei Verwendung von Triglyceriden mit einemverschlechterten Stoffaustausch/-übergang, erhöhten Energieeintragund Ausbeuteverlusten durch Substratanhaftung und -wanderung anReaktoroberflächenzu rechnen.
    [0005] Auchdie Verwendung von freien Fettsäurenfür Kultivierungenist als nachteilig anzusehen, weil sie einerseits eine starke Ansäuerung desMediums bewirken, verbunden mit einem erhöhten Laugebedarf für die Neutralisierung,und andererseits bei Nutzung von Salzen der Fettsäuren erheblicheMengen zusätzlicherCa- oder Na-Kationen in das Medium eingebracht werden. Aufgrundder Seifenbildung ist in beiden Fällen bei Belüftung mitSchaumbildung zu rechnen.
    [0006] ZurGewinnung von aliphatischen Dicarbonsäure (> C9), ist aus US 6,569,670 B2 einFermentationsverfahren bekannt, bei dem Fette, z.B. freie Fettsäuren gegebenenfallsim Gemisch mit Fettsäuremethylestern alsFermentationshilfe, dem Fermentationsmedium zur Veränderungder rheologischen Eigenschaften des Mediums (Viskositätsverminderung)und bei der Bildung von speziell geformten Dicarbonsäurepartikelzugesetzt werden. Es werden Hefen (z.B. der Gattung Candida sp.)eingesetzt, deren Befähigungzur β-Oxidationvon Fettsäurenblockiert ist. Die Fettsäuremethylesterwerden im beschriebenen Verfahren nicht metabolisiert, vielmehrwird eine leicht utilisierbare Kohlenstoff- und Energiequelle (z.B.Glucose) fürdie quasi cooxidative Bildung der längerkettigen Dicarbonsäuren zugegeben.
    [0007] DieAufgabe der Erfindung besteht darin, die biotechnologischen Verfahrenzur Gewinnung von funktionalisierten Di- und Tricarbonsäuren des Tricarbonsäurecycluszu verbessern, und Kohlenstoff- und Energiequellen (Substrate) für die Kultivierungzu erschließen,welche hohe Produktkonzentrationen und substratbezogene Produktausbeutenermöglichen,ernährungsphysiologischunbedenklich sind und die verfahrenstechnischen Nachteile bishergenutzter lipophiler Substrate, wie Triglyceride und freier Fettsäuren, vermeiden,wobei eine vollständigeMetabolisierung (inklusive β-Oxidation)der Substrate wünschenswertist.
    [0008] Eswurde überraschenderweisegefunden, dass funktionalisierte Di- und Tricarbonsäuren desTricarbonsäurecyclusin hoher Ausbeute durch Kultivierung von Mikroorganismen, die zurSpaltung von Monocarbonsäurealkylesternund gleichzeitig zur β-Oxidationder bei der Spaltung gebildeten Monocarbonsäuren (Fettsäuren) befähigt sind, unter aeroben submersenBedingungen in einem Nährmedium,das mindestens einen Alkylester gesättigter und/oder ungesättigterunverzweigter Monocarbonsäurenmit einer Kettenlängevon 8 bis 22 C-Atomen als assimilierbare Hauptkohlenstoffquelleumfasst, hergestellt werden können.Vorzugsweise erfolgt die Kultivierung bei Temperaturen im Bereichvon 20 bis 38°Cund bei einem pH-Wert im Bereich von 3,0 bis 6,5. Die Gelöstsauerstoffkonzentrationwird bevorzugt im Bereich von 10% bis 90% der Luftsättigunggehalten. Vorzugsweise werden Belüftungsraten eingestellt, welcheeine Luftsättigungvon über40% gewährleisten.
    [0009] Alsbevorzugte Mikroorganismen mit den gewünschten Eigenschaften habensich säureakkumulierendeHefen gezeigt, vorzugsweise säurebildendeHefen der Gattungen Candida, Pichia oder Yarrowia, insbesondereHefestämmevon Yarrowia lipolytica. Ganz besonders bevorzugt werden die Stämme Yarrowialipolytica H181 (ursprünglichals Saccaromycopsis lipolytica H181 bezeichnet) und Yarrowia lipolyticaH222-27-11 eingesetzt,welche bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH, Braunschweig, Deutschland unter DSM 7806 (H181) und DSM 8068(H222-27-11) hinterlegt sind. Die Hinterlegung des Stammes DSM 7806wurde am 25.10.1983 unter ZIMET 43720 registriert, für den StammDSM 8068 erfolgte die Registrierung unter ZIMET 43856 am 08.12.1987.Beide Stämmewurden am 04.06.2004 gemäß den Bedingungendes Budapester Vertrages überdie internationale Anerkennung von Mikroorganismen für die Zwecke vonPatentverfahren verlängert.
    [0010] DieKultivierung erfolgt bei bevorzugten Temperaturen zwischen 26 und33°C, vorzugsweisebei 30°C. Mikroorganismenstämme, diezur Spaltung von Monocarbonsäurealkylesternund zur β-Oxidationder bei der Spaltung gebildeten Fettsäuren befähigt sind, werden unter aeroben,submersen Bedingungen in üblichen,bekannten synthetischen oder halbsynthetischen Nährmedien für das Zielprodukt, die Di-bzw. Tricarbonsäureausscheidungkultiviert, wobei die eigentliche Bildung und Akkumulation der Säuren inbekannter Weise durch Limitation der Stickstoffquelle (z.B. NH4) oder einer anderen anorganischen Medienkomponentewie Phosphor oder Schwefel und/oder Vitaminmangel (z.B. Thiamin)bei auxothrophen Stämmenausgelöstwird.
    [0011] DieKohlenstoffquelle wird dem Medium nach bekannten Kultivierungsregimesentweder bereits zu Beginn der Kultivierung (batch-Betrieb) vollständig zugeführt oderes erfolgt zu bestimmten Zeitpunkten eine Nachdosierung des Substrates(fed-batch). Selbstverständlichsind auch semikontinuierliche und kontinuierliche Verfahren mitFettsäurealkylesterndurchführbar.Der Verlauf der Kultivierung lässtsich i.d.R. in eine Wachstums- und Produktbildungsphase unterteilen.Die mikrobielle Wachstumsphase bis zur Auszehrung der limitierendenMedienkomponente (z.B. Stickstoff) beträgt in Abhängigkeit von deren Konzentrationgewöhnlich zwischen10 und 24 Stunden. Die daran anschließende Produktbildungsphasefür diegewünschteSäure erfolgtbis zur vollständigenUtilisation des Fettsäurealkylestersals Kohlenstoffquelle. Üblicherweisewird sie aber zu einem ökonomischenZeitpunkt bezüglichder Raum-Zeit-Ausbeuten abgebrochen.
    [0012] DieErfindung zeichnet sich insbesondere dadurch aus, dass dem Mediumals assimilierbare Kohlenstoffquelle Fettsäurealkylester als Gemischeoder Einzelkomponenten bevorzugt in einer Konzentration von 20 bis175 g/l zugesetzt werden. In Abhängigkeitvon der wachstumlimitierenden Medienkomponente (z.B. Stickstoff)könnenaber auch niedrigere oder höhereEsterzugaben verwertet werden. Die Fettsäurealkylester können separatautoklaviert oder pasteurisiert werden. Auch die gemeinsame Sterilisierungmit den anderen Medienbestandteilen ist möglich.
    [0013] Hinsichtlichihrer Struktur werden erfindungsgemäß folgende Fettsäurealkylester-Gruppenbevorzugt füreine Kultivierung eingesetzt: Methylester undEthylester gesättigterund ungesättigterunverzweigter Monocarbonsäuren(Alkansäuren) mitder KettenlängeC8 bis C22; davonsind alle bei den bevorzugten Kultivierungstemperaturen von 26 bis 33°C im flüssigen Aggregatzustandvorliegenden Ester der natürlichenFettsäuren,wie z.B. die Ester der Laurin-, Myristin-, Palmitin-, Öl-, Linol-und/oder Linolensäurebesonders geeignet. Gemische zweier oder mehrerer, der unter 1. benannten Methyl-oder Ethylester von Alkansäurenz.B. die Gemische der Alkansäureestervon Pflanzenölen,tierischen Fetten und Ölen,gereinigten Altfetten mit besonderer Eignung als Biokraftstoffe,welche unter dem Begriff Biodiesel erfasst werden. Gemische der unter 1. genannten Methyl- und Ethylester von Monocarbonsäuren mitGlycerin, bevorzugt die Gemische welche insbesondere bei der Gewinnungder als Biodiesel bezeichneten Biokraftstoffen nach der Veresterungsstufemit Methanol oder Ethanol anfallen und der verbleibende Alkoholgehaltkeine toxische Wirkung auf die eingesetzten Hefekulturen hat oderGemische aus Biodiesel und Triglyceriden. Gemische der unter 1. genannten Methyl- umd Ethylester von Monocarbonsäuren mitanderen utilsierbaren Kohlenstoffquellen, bevorzugt die Gemischewelche aus der Anwendung von Biodiesel als Lösungsmittel für Fetteund Farben anfallen und deren anderen Betandteile keine toxischeWirkung auf die eingesetzten Hefekulturen hat.
    [0014] Gemäß der Erfindungermöglicheninsbesondere die Kohlenstoffquellen aus nachwachsenden Rohstoffen(Alkylester der Pflanzenöle)eine effiziente Biosynthese der organischen Di- und Tricarbonsäuren mit bevorzugtsäureakkumulierendeHefen unter aeroben, submersen Bedingungen, wobei besonders bevorzugt Biodieselals assimilierbare Kohlenstoffquelle dient.
    [0015] Biodiesel,der weltweit als alternativer Kraft- und Brennstoff gewonnen wird,ist eine neue preiswerte Substratklasse für Biosynthesen. Als Biodieselwerden Gemische von Methyl- und/oderEthylestern der FettsäurennatürlicherPflanzenöle,aber auch aus Altfetten der fett- und ölverarbeitenden Industrie bezeichnet.Biodiesel wird derzeit als Kraftstoffersatz und -zusatz für Mineralöldieselin der Kraftfahrzeugtechnik verwendet und steht praktisch unbegrenztzur Verfügung.Seine Herstellung aus Triglyceriden und Methanol oder Ethanol isttechnisch einfach zu realisieren (z.B. CD- Prozess). Als Nebenprodukt der katalytischenUmesterung entsteht Glycerol, welches in gereinigter Form eine breiteAnwendung (z.B. Kosmetikindustrie) finden kann.
    [0016] DieGewinnung von Biodiesel erfolgt z.B. aus Rapsöl, Sonnenblumenöl, Palmöl, Sojaöl und Talgum nur stellvertretend einige zu nennen. Sie werden je nach verwendetenPflanzenölen(Triglyceriden) z.B. auch als Methylraps, Rapsmethylester (RME),Rapsethylester (REE), Palmmethylester (PME) oder Sojamethylester (SME)bezeichnet.
    [0017] ImeuropäischenRaum ist Biodiesel insbesondere in der Form von Fettsäuremethylester-Gemischen, bevorzugtals Methylestergemische von Rapsöleingeführtund wird auch als Methyl Raps, Rapsmethylester (RME) oder Rapsdieselbezeichnet.
    [0018] Fettsäuremethylester(FAME) besitzen eine ca. auf 1/10 reduzierte Viskosität bei 20°C im Vergleich mitden natürlichenPflanzenölen.Ebenso sind die Schmelzpunkte im Vergleich mit Triglyceriden undFettsäurenerheblich erniedrigt. Im Vergleich zu freien Fettsäuren sinddie FAME pH-neutral.
    [0019] Biodieselist bekanntermaßenbiologisch leicht abbaubar und eine Gefährdung für Boden und Grundwasser wirdausgeschlossen. So ist z.B. auch die Aufnahme in Säugetierzellenund die Metabolisierung von C16- und C18-Fettsäuremethylestern über dieHydrolyse zu freien Fettsäurenund dem korrespondierenden Alkohol (Methanol) bis hin zur vollständigen Oxidationzu CO2 und Wasser beschrieben, so dass voneiner physiologischen Unbedenklichkeit von Biodiesel für den Menschenausgegangen werden kann.
    [0020] Dieerfindungsgemäße Herstellungvon funktionalisierten Di- undTricarbonsäuren,insbesondere unter Verwendung von Biodiesel, ermöglicht die vollständige Utilisierung(inklusive β-Oxidation)der Substrate und erlaubt eine anschließende de novo Synthese der Zielprodukte.Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren werdenhohe substratbezogene Ausbeuten von ca. 1,5 g bis 1,8 g Di- oderTricarbonsäurepro g eingesetzten Fettsäurealkylesternerzielt, welche weit überden bekannten Verfahren liegen.
    [0021] Dieerfindungsgemäße Verwendungvon Fettsäurealkylesternals Substrate ist mit deutlichen verfahrenstechnischen und ökonomischenVorteilen im Vergleich zum gegenwärtigen Stand der Technik verbunden. DieseVorteile könnenwie folgt zusammengefasst werden: – Anwendungals 100 Substrat ohne Verdünnungoder Vorlösung,wie bei Glucose, Saccharose oder Melassen erforderlich, – Bevorratungder Kohlenstoffquelle fürdie Gesamtzeit der Fermentation bei batch-Betrieb, – keineGefahr einer Zersetzung oder Karamelisierung bei der Sterilisation,wie bei Glucose oder Stärkehydrolysaten, – niedrigeViskositätder Fermentationslösungauch bei hohen Konzentrationen des Substrates (im Vergleich mitPflanzenölenoder tierischen Ölen),was einen deutlich geringeren Energieeintrag für Rührung und Belüftung bedeutet, – keinebeobachtete ToxizitätgegenüberMikroorganismen auch bei hohen Konzentrationen (im Gegensatz zuAcetat, Ethanol), – keineSchaumbildung (im Gegensatz zu Glucose, Saccharose, Hydrolysatenund Fettsäuren), – keinezusätzlicheAnsäuerungdes Fermentationsmediums, wie bei Einsatz freier Fettsäuren (Einsparung vonNeutralisationsreagenzien) – Fettsäurealkylesterlösen Sauerstoffin höherenKonzentrationen als Wasser und stellen somit ein O2-Reservoirfür dieHefekulturen dar, – Mischsubstratverwertungvon festen ölenund Biodiesel wird ermöglicht, – erleichtertekontinuierliche Prozessführungdurch einfache Substratdosierung (keine Entmischung von Lösungen,niedrige Viskosität), – keinephysiologischen Bedenken (im Gegensatz zu Paraffinen).
    [0022] Anhandeiniger ausgewählterSynthesen von bevorzugt produzierten Säuren des Tricarbonsäurezykluswird die Erfindung im Detail dargestellt ohne sie darauf zu beschränken.
    [0023] Citronensäure wirdbevorzugt dadurch gewonnen, dass man an sich bekannte citronensäureakkumulierendeHefestämmeder Gattungen Candida, Pichia und Yarrowia, vorzugsweise von Yarrowialipolytica, verwendet, die zur β-Oxidationbefähigtsind. Dabei könnensowohl Hefen genutzt werden, die in Form von Mutanten oder rekombinantenStämmezur überwiegendenAkkumulierung von Citronensäure(> 90% der gebildetenSäuren)befähigtsind als auch Wildtypstämme,die ein Gemisch von Citronen- und Isocitronensäure bilden und bei deren Kultivierungeine Aconitase-hemmende Verbindung wie z.B. Fluoressigsäure zugegeben wird.
    [0024] DieHefestämmewerden unter aeroben, submersen Bedingungen in üblichen, bekannten synthetischenoder halbsynthetischen Nährmedienfür dieCitratausscheidung kultiviert, wobei die eigentliche Bildung undAkkumulation der Säurein bekannter Weise durch Limitation der Stickstoffquelle (z.B. NH4 +) oder einer anderenMedienkomponente wie Phosphor oder Schwefel ausgelöst wird.Dem Medium wird eine optimale stammspezifische Thiaminkonzentrationim Bereich von 100 μgbis 2 mg/l Thiamin × HCIzugegeben. Die Kultivierung erfolgt bei einem pH-Wert von 3,5 bis6,5 und einer Temperatur von 26 bis 33°C, vorzugsweise bei pH = 5,0und einer Temperatur von T = 30°C.Die Gelöstsauerstoffkonzentrationwird währendder gesamten Kultivierung im Bereich von 10% bis 90% der Luftsättigunggehalten, wobei vorzugsweise Belüftungsrateneinge stellt werden, welche eine Luftsättigung von über 40%gewährleisten.Dementsprechend wird bei Verwendung von Schüttelkolben die Einstellungeiner hohen Schüttelfrequenzvorgesehen.
    [0025] DieKohlenstoffquelle wird dem Medium nach bekannten Kultivierungsregimesentweder bereits zu Beginn der Kultivierung (batch-Betrieb) vollständig zugeführt oderes erfolgt zu bestimmten Zeitpunkten eine Nachdosierung des Substrates(fed-batch). Selbstverständlichsind auch semikontinuierliche und kontinuierliche Verfahren mitFettsäurealkylesterndurchführbar.Der Verlauf der Kultivierung lässtsich, wie fürdie Citratbildung mit Hefen typisch in eine Wachstums- und Produktbildungsphaseunterteilen. Die mikrobielle Wachstumsphase bis zur Auszehrung derlimitierenden Medienkomponente (z.B. Stickstoff) beträgt in Abhängigkeit vonderen Konzentration gewöhnlichzwischen 10 und 24 Stunden. Die daran anschließende Produktbildungsphasefür Citronensäure erfolgtbis zur vollständigenUtilisation des Fettsäurealkylestersals Kohlenstoffquelle. Üblicherweisewird sie aber zu einem ökonomischenZeitpunkt bezüglichder Raum-Zeit-Ausbeutenabgebrochen. Die Gesamtkultivierungszeit dauert im Allgemeinen etwa90 bis 250 Stunden in Abhängigkeitvon der eingesetzten Menge der Kohlenstoffquelle und den gewählten Kultivierungsbedingungen(z.B. Schüttelkolben- oderReaktorkultivierung).
    [0026] Mitdem erfindungsgemäßen Verfahrenwerden hohe substratbezogene Ausbeuten bis zu 1,5 g Citronensäure prog eingesetzten Fettsäurealkylesternerzielt, welche weit überden bekannten Verfahren mit A. niger unter Verwendung von Kohlenhydratenliegen und die Ausbeuten bei Verwendung von Triglyceriden und Fettsäuren erreichen.Im Gegensatz zu den bekannten Verfahren mit anderen Kohlenstoffquellenist das Verfahren aufgrund einer mit ihr verbundenen reduziertenViskositätund Oberflächenspannungdes Kultivierungsmediums (Absenkung des Energieeintrages, verbesserteDispergierung), Vermeidung der Verseifung des Mediums (Unterdrückung derSchaumbildung) und effizienten Nutzung von Alkansäuren, diebei Kultivierungstemperaturen von 26–33°C in fester Form vorliegen,von Vorteil.
    [0027] Auchfür dieGewinnung von D-Isocitronensäure(1-Hydroxy– propan-1,2,3-tricarbonsäure) kannvorteilhafterweise jeder bekannte Hefestamm der Gattungen Candidaoder Yarrowia, der zur β-Oxidationbefähigt ist,verwendet werden, der als Wildtypstamm ein Gemisch von Citronen-und Isocitronensäureakkumuliert, wobei der Isocitratgehalt gewöhnlich zwischen 40% und 60%der Gesamtsäurebildungliegt. Daneben können Mutantenoder gentechnisch veränderteStämmevon Candida oder Yarrowia genutzt werden, die befähigt sind,höhereAnteile an Isocitronensäurezu akkumulieren. Abweichend zur Gewinnung von Citronensäure ist derpH-Wert vorzugsweise bei pH = 6,0 zu statieren.
    [0028] DieGewinnung von 2-Oxoglutarsäure(2-Oxo-pentan-1,5-dicarbonsäure) erfolgtbevorzugt mit Hilfe von thiaminauxotrophen Hefestämmen, wiez.B. der Hefeart Yarrowia lipolytica. Bekanntermaßen bildendiese Hefen unter Thiaminmangelbedingungen überwiegend 2-Oxoglutarsäure, wennKohlenstoffquellen eingesetzt werden, die über die β-Oxidation metabolisiert werden.Für dieeffiziente selektive Gewinnung von 2-Oxoglutarsäure aus Fettsäurealkylesternkann z.B. die Leistungsmutante Yarrowia lipolytica H222-27-11 (DSM 8068)kultiviert werden. Im Unterschied zur Gewinnung von Citronensäure isteine geringere Thiaminkonzentration von 0,05–1 μg/l erforderlich und pH-Wertwährendder Kultivierung auf einen Bereich von vorzugsweise 3,0–4,0 einzustellen.
    [0029] DieGewinnung von Aconitsäureund Itaconsäureerfolgt analog.
    [0030] Inden nachfolgenden Beispielen wird die Erfindung näher beschrieben.
    [0031] DerStamm Yarrowia lipolytica H181 (DSM 7806) wurde auf Pepton HefeextraktAgar (Fluka, Nr. 77196) oder einem anderen geeigneten Agarmedium(z.B. Reader-Agar) fürHefen für12 bis 24 Stunden bei 30°Ckultiviert. Von der gewachsenen Agarkultur wurden 2 bis 3 Impfösen auf100 ml sterilisierte mit destilliertem Wasser hergestellte YM-Bouillon(BD Difco, Nr. 271120) folgender Zusammensetzung Glucose 10,0g/l Hefeextrakt 3,0g/l Malzextrakt 3,0g/l Polypepton 5,0g/l überimpftund bei pH 6 in 500 ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen bei 30 °C für 24 h aufeiner Schüttelapparaturbei einer Schüttelfrequenzvon 130 bis 150 rpm kultiviert.
    [0032] Vondieser Vorkultur erfolgte die Überimpfungdes Inokulum in sterile 500 ml Schüttelkolben mit Schikanen miteinem Füllvolumenvon insgesamt 100 ml. Das Volumenverhältnis der Überimpfung betrug 1:10. Das Kultivierungsmediumwurde bei 121 C und 1 bar Überdruckfür 20min sterilisiert und enthielt folgende unter Verwendung von destilliertemWasser zugefügteKomponenten: (NH4)2SO4 2,0g/l KH2PO4 0,125g/l MgSO4 × 7H2O 0,1g/l Maisquellwasser 2,6g/l CaCO3 5,0g/l Thiamin × HCI 100,0 μg/l.
    [0033] Thiamin × HCI wurdeabweichend von den anderen Komponenten sterilfiltriert. Dem Mediumwurde als Substrat ein sterili sierter (15 min, 121°C, 1 bar)oder pasteurisierter (30 min, 80°C)aus Rapsölgewonnener Biodiesel (Methyl Raps) in einer Konzentration von 50g/l zugesetzt. Der Biodiesel bestand aus einem Gemisch (Masseprozente)folgender Fettsäuremethylester(FAME): Palmitinsäuremethylester (16:0)4,8 Stearinsäuremethylester (18:0)1,9 Ölsäuremethylester (18:1)57, Vaccensäuremethylester (18:1)2,4 Linolsäuremethylester (18:2)20; Linolensäuremethylester (18:3)8,2 Archinsäuremethylester (20:0)0,6 Eiconsensäuremethylester (20:11,7 Erucasäuremethylester (22:1)0,4 andereFAME 2,2%
    [0034] DieKultivierung erfolgte bei 30°Cauf einer Schüttelapparaturbei einer Schüttelfrequenzvon 130 bis 150 rpm. Der pH-Wertin den Schüttelkolbenwurde durch Zugabe von 5 g/l CaCO3 und steriler20%iger NaOH im Bereich pH 4,5 bis 5,5 gehalten. Nach 142 Stundenwurde die Kultivierung beendet. Die Konzentration der gebildetenorganischen Säurenbetrug 58 g/l Citronensäureund 2,3 g/l Isocitronensäure,entsprechend einer Gesamtsäureproduktion60 g/l. Die substratbezogene Ausbeute für Citronensäure betrug 1,2 g CS/g Biodiesel beieiner Raum-Zeit-Ausbeute von 0,4 g CS/(l·h).
    [0035] DieKultivierung erfolgte wie in Beispiel 1 beschrieben. Anstelle vonBiodiesel (Methyl Raps) wurden 50 g/l Ölsäureethylester (Ethyl Oleat)als Substrat dem Medium zugesetzt. Nach 142 Stunden Kultivierungbetrug die im Kulturmedium gebildete Menge an Säuren 53 g/l, davon waren 51g/l Citronensäureund 2 g/l Isocitronensäure.Dies entsprach einer substratbezogenen Ausbeute für Citronensäure von1 g/g und Raum-Zeit-Ausbeute von 0,36 g CS/(l·h).
    [0036] DerHefestamm Yarrowia lipolytica H181 (DSM7806) wurde für 12 bis24 h bei 30°Cauf Pepton Hefeextrakt Agar (Fluka, Nr. 77196) inkubiert. Von derAgarkultur wurden 2 bis 3 Impfösenabgeimpft und in 500 ml Schüttenkolbenmit Schikanen für24 h bei 30°Cauf einer Schüttelmaschinebei einer Schüttelfrequenzvon 130 bis 150 rpm kultiviert. Die Schüttelkulturen für Inokulumgewinnungenthielten 100 ml sterile Nährlösung (Vorkulturmedium)folgender Zusammensetzung: NH4CI 1,50g/l KH2PO4 0,40g/l MgSO4 × 7H2O 0,20g/l Hefeextrakt 2,5g/l Spurensalzlösung 5m/l FeSO4 × 7H2O 3,5mg/l CaCO3 5g/l
    [0037] DieNährsalzewurden in dest. Wasser gelöst,die sterile Spurensalzlösungenthielt folgende Komponenten: CuSO4 × 5H2O 4,0g/l MnSO4 × 5H2O 4,0g/l ZnCl2 2,1g/l CoSO4 × 7H2O 0,5g/l H3BO3 5,7g/l.
    [0038] DiesemVorkulturmedium wurde als Substrat der in Beispiel 1 beschriebeneBiodiesel (Rapsmethylester) in einer Konzentration von 20 g/l zugesetzt.Ausgehend von dieser Vorkultur erfolgte die Überimpfung des Inokulum ineinem Verhältnisvon 1:10 in sterile 500 ml Schüttelkolbenmit Schikanen mit einem Füllvolumen von100 ml. Die sterile Nährlösung (Hauptkulturmedium)enthielt NH4CI 1,50g/l KH2PO4 0,40g/l MgSO4 × 7H2O 0,20g/l Spurensalzlösung 5ml Thiamin × HCI 1,0mg/l FeSO4 × 7H2O 3,5mg/l CaCO3 5,0g/l.
    [0039] MitAusnahme des Thiamin (gesonderte Sterilisation durch Filtration)wurden die Nährsalzein dest. Wasser gelöstwurden und fürbei 121 °Cund 1 bar Überdruckfür 15min sterilisiert. Die Spurensalzlösung hatte die gleiche Zusammensetzungwie fürdie Inokulumgewinnung. Dem Medium wurde als Substrat der in Beispiel1 beschriebene Biodiesel (Methyl Raps) in einer Konzentration von70 g/l zugesetzt. Die anschließendeKultivierung erfolgte bei 30°Cauf einer Schüttelapparaturbei einer Schüttelfrequenzvon 130 bis 150 rpm. Der pH-Wert in den Schüttelkolben wurde durch Zugabevon 5 g/l CaCO3 und steriler 20%iger NaOHim Bereich pH 4,5 bis 5,5 gehalten.
    [0040] Nach217 Stunden wurde die Kultivierung beendet. Die Gesamtkonzentrationder gebildeten organischen Säurenbetrug 98 g/l davon waren 94 g/l Citronensäure und 4 g/l Isocitronensäure. Diesubstratbezogene Ausbeute fürCitronensäurebetrug 1,3 g CS/g Biodiesel und die Raum-Zeit-Ausbeute für Citronensäure lag bei0,4 g/(l·h).
    [0041] DasInokulum (Vorkultur) des Hefestammes Yarrowia lipolytica H181 wurdewie in Beispiel 3 gewonnen. Ein 2 l-Rührreaktor wurde mit 1.075 mldes in Beispiel 3 beschriebenen Hauptkulturmediums und 120 ml des24 h gewachsenen Inokulum befüllt.Dem Rührreaktorwurden als C- und Energiequelle 105 ml des in Beispiel 1 beschriebenenBiodiesels zugesetzt, was einer Substratkonzentration von 70 g/lentsprach.
    [0042] DieKultivierung erfolgte unter sterilen Bedingungen bei einer Temperaturvon 30°Cund einer Gelöstsauerstoffkonzentrationvon pO2 = 40%. Die sterile Belüftung betrugdementsprechend 0,5–1,2VVM und die Rührerdrehzahl800–1200rpm. Der pH-Wert wurde bei pH = 5,0 mit 30%iger NaOH statiert. Nach96 Stunden Kultivierung hatten sich 102 g/l Citronensäure und4 g/l Isocitronensäuregebildet. Dies entsprach einer substratbezogenen Ausbeute für Citronensäure von1,5 g/g Biodiesel. Die Raum-Zeit-Ausbeuten betrug 1,05 g/(l·h). AlsNebenprodukt wurden nur 4 g/l Isocitronensäure gebildet.
    [0043] Diein Beispiel 4 beschriebene Kultivierung wurde in der Form wiederholt,dass der verwendete Hefestamm durch den Stamm Yarrowia lipolyticaH222 (MATA), Wildtyp ersetzt und der pH-Wert auf 6,0 statiert wurde. Nach einerKultivierungsdauer von 92 Stunden wurde ein Gemisch von 103 g/lorganischen Säurengebildet, welches 48 g/l Isocitronensäure (ICS) und 55 g/I Citronensäure (CS)enthielt. Die substratbezogene Ausbeute für die gebildeten Gesamtsäuren (CS+ ICS) betrug 1,5 g/g Biodiesel, speziell für Isocitronensäure 0,7g/g und fürCitronensäure0,8 g/g.
    权利要求:
    Claims (16)
    [1] Verfahren zur biotechnologischen Herstellungvon funktionalisierten Di- und Tricarbonsäuren, dadurch gekennzeichnet,dass man Mikroorganismen, die zur Spaltung von Monocarbonsäurealkylesternund zur β-Oxidationder bei der Spaltung gebildeten Monocarbonsäuren (Fettsäuren) befähigt sind, unter aeroben submersenBedingungen in einem Nährmedium,das mindestens einen Alkylester gesättigter und/oder ungesättigterunverzweigter Monocarbonsäurenmit einer Kettenlängevon 8 bis 22 C-Atomenals assimilierbare Hauptkohlenstoffquelle umfasst.
    [2] Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,dass man als Mikroorganismen säureakkumulierendeHefen verwendet, vorzugsweise säurebildendeHefen der Gattungen Candida, Pichia oder Yarrowia.
    [3] Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,dass man Hefestämmevon Yarrowia lipolytica verwendet.
    [4] Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet,dass man die HefestämmeYarrowia lipolytica H181 (DSM 7806) und H222-27-11 (DSM 8068) verwendet.
    [5] Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet,dass man die Kultivierung bei Temperaturen im Bereich von 20 bis38°C, vorzugsweiseim Bereich von 26 und 33°Cdurchführt.
    [6] Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet,dass man die Kultivierung bei einem pH-Wert im Bereich von 3,0 bis6,5 durchführt.
    [7] Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet,dass man Methylester und Ethylester der Monocarbonsäuren alsEinzelkomponente oder im Gemisch als Kohlenstoffquelle verwendet.
    [8] Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet,dass man Biodiesel, hergestellt aus Pflanzenölen oder tierischen Fettenund Ölen,als Kohlenstoffquelle verwendet.
    [9] Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet,dass man mindestens einen Alkylester der Monocarbonsäuren imGemisch mit Glycerin als Kohlenstoffquelle verwendet.
    [10] Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet,dass man ein Gemisch aus Biodiesel und Glycerin aus der Gewinnungvon Biodiesel nach der Veresterungsstufe als Kohlenstoffquelle verwendet.
    [11] Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet,dass man ein Gemisch aus Biodiesel und Triglyceriden als alleinigeKohlenstoff- und Energiequellen verwendet.
    [12] Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet,dass man ein Gemisch aus Biodiesel und einer anderen Kohlenstoffquelleverwendet, welches als Abprodukt aus der Nutzung von Biodiesel alsLösungsmittelanfällt.
    [13] Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet,dass man Biodiesel aus Rapsöl,Sojaöl,Sonnenblumenöl,Palmölund/oder Talg verwendet.
    [14] Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet,dass man Methyl und Ethylester von Monocarbonsäuren verwendet, die bei denKultivierungstemperaturen im flüssigenAggregatzustand vorliegen, vorzugsweise die Ester der Laurin-, Myristin-,Palmitin-, Öl-,Linol- und/oder Linolensäure.
    [15] Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet,dass man die assimilierbare Kohlenstoffquelle in einer Konzentrationvon 20 bis 175 g/l zusetzt.
    [16] Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15 zur Herstellungvon Di- und Tricarbonsäuren,vorzugsweise der im Tricarbonsäurecyclusvorkommenden Citronensäure,Isocitronensäure,2-Oxoglutarsäure,Aconitsäureund/oder Itaconsäure.
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    DE102004028179B4|2006-12-14|
    引用文献:
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